雜交瘤技術(shù)簡介

雜交瘤一般是指我們將骨髓瘤細胞和免疫B淋巴細胞進行融合,，形成能分泌高度純一單克隆抗體的雜交瘤細胞的技術(shù),，由諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者Georges Kohler和Cesar Milstein于1975年發(fā)明?？贵w是由免疫的B淋巴細胞分泌的球蛋白,，各個淋巴細胞分泌的抗體各不相同，因而要獲得一種獨特的抗體只有從一個B淋巴細胞產(chǎn)生的細胞群制取,。然而B淋巴細胞在體外不能長期存活,，分裂2-3次即要死亡，因而無法得到由一個淋巴細胞的后代細胞群分泌的大量抗體,。骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)條件下具有無限繁衍的特性,，將免疫B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，這種雜交細胞遺傳雙親細胞的特性,，既能像B淋巴細胞一樣分泌抗體,，又能像骨髓瘤細胞一樣無限增殖，這樣我們就得到了能夠在體外不斷擴增同時分泌抗體的雜交瘤細胞,。

雜交瘤技術(shù)基本流程

雜交瘤技術(shù)的基本流程主要包括：免疫抗原制備—動物免疫—細胞融合—雜交瘤細胞篩選—亞克隆及抗體特異性檢測—抗體大量制備,。

（1）免疫抗原制備

一般免疫抗原可選蛋白、多肽,、小分子等,。依據(jù)需求選擇和制備合適的免疫原對于抗體開發(fā)至關(guān)重要。

知禾特色：可根據(jù)客戶要求定制靶點蛋白

（2）動物免疫

通常選用Balb/c小鼠作為免疫動物,，免疫途徑主要有皮下注射,、腹腔注射等。

常規(guī)免疫周期如下：第一次免疫（抗原+弗氏完全佐劑,，皮下注射）、第二次免疫（抗原+弗氏不完全佐劑,，皮下注射）,、第三次免疫（抗原+弗氏不完全佐劑，皮下注射）、沖擊免疫（抗原+弗氏不完全佐劑,，腹腔注射）,。

知禾特色：采用獨特的水溶性免疫佐劑，5周即可達到常規(guī)佐劑免疫8周的同等效果,，同時可為客戶根據(jù)抗原的特性制定免疫方案,。

（3）細胞融合

①骨髓瘤細胞制備：

骨髓瘤細胞應(yīng)該和免疫動物屬于同一品系，融合前骨髓瘤細胞應(yīng)處于對數(shù)生長期,，融合前培養(yǎng)不能少于1周,；凍存復(fù)蘇后的骨髓瘤細胞要生長2周才可達到適用于融合的狀態(tài)。
②飼養(yǎng)細胞制備：

通常在融合前一天,，采用小鼠腹腔巨噬細胞和正常脾細胞作為融合飼養(yǎng)層,。飼養(yǎng)細胞釋放生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件,，此功能也可通過添加相應(yīng)細胞因子代替,；同時飼養(yǎng)細胞也可滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。

③脾細胞制備：

小鼠處死前摘眼球取血,，分離血清作為檢測時的陽性對照,。取免疫小鼠的脾臟，研磨,、過濾,、離心后可得脾細胞，通常每只免疫小鼠可得約1x108個脾細胞,。

④細胞融合：細胞融合方法有病毒介導(dǎo)的細胞融合,、聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)細胞融合、電融合,。PEG是使相鄰細胞質(zhì)膜融合,，形成具有兩個或更多核的單細胞。電融合是通過施加脈沖電場連接相鄰細胞的膜,。電融合比PEG更加有效,，結(jié)果具有重現(xiàn)性。

知禾特色：采用高效電融合促進劑,，一次融合最多100-200塊96孔板

（4）雜交瘤細胞篩選

細胞融合是一個隨機的物理學(xué)過程,，融合后細胞將以多種形式出現(xiàn)。因此要利用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞,，HAT培養(yǎng)基中有3種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤(hypoxanthine,，H)、甲氨蝶呤(aminopterin,，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,，T),。

正常細胞的核苷酸合成有兩個途徑：全合成途徑和補救合成途徑。全合成途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸,，進而合成DNA,，該過程會被A阻斷；補救合成途徑是在H和T存在的情況下,，經(jīng)過次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化合成核苷酸,，進而合成DNA，而所用的骨髓瘤細胞缺乏HGPRT而不能通過補救合成途徑合成DNA,，使得骨髓瘤細胞不能在該培養(yǎng)基中生長,。正常的脾細胞在培養(yǎng)基中僅能存活5-7天，無需特別篩選,，因此只有融合的雜交瘤細胞,，可在HAT培養(yǎng)基中長期存活與繁殖。培養(yǎng)7-10天后取上清液用ELISA法選出抗體高分泌性的細胞群,。

（5）雜交瘤亞克隆及抗體特異性檢測

將融合后抗體高分泌性的細胞群進行充分稀釋,，使克隆細胞數(shù)在0-0.5cell/孔之間，改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)后取上清液用ELISA法選出抗體高分泌性的細胞株,，將這些陽性細胞再進行克隆化,，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標抗原的抗體陽性單克隆細胞株，同時對所產(chǎn)生抗體進行流式檢測,、親和力測定等相關(guān)檢測,，將定株細胞增殖后進行凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng),。

知禾特色：使用無血清細胞凍存液凍存候選克隆,，延長檢測周期。

（6）單克隆抗體大量制備

利用雜交瘤細胞大規(guī)模制備單克隆抗體主要有兩種方式：體外培養(yǎng)法和腹水制備法,。

體外培養(yǎng)可以采用單層細胞培養(yǎng)的形式,，也可以采用懸浮培養(yǎng)的形式。如果想在體外高效率地大量制備單克隆抗體,，就必須高密度培養(yǎng)雜交瘤細胞,，充分利用培養(yǎng)基的立體空間。單位體積內(nèi)細胞數(shù)量越多,，產(chǎn)生的單克隆抗體就越多,，濃度就越高，產(chǎn)量就越大,。

腹水制備法是通過將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生腹水,，可得到大量的腹水單抗。這種方式能夠在相對短的時間內(nèi)獲得大量高濃度的抗體,，而且成本低,、操作相對簡單,。小鼠腹水中常伴有小鼠體內(nèi)的各種雜蛋白，因此需要純化后進行使用,，同時也可能會有污染動物病毒的危險。

知禾特色服務(wù)：釣基因——因雜交瘤細胞大多數(shù)都不夠穩(wěn)定,，且窗口期較短,，不少科研工作者都困擾于篩選結(jié)果出來了，但是細胞卻已經(jīng)丟失抗體分泌能力,，甚至死亡,。

知禾采用小鼠抗體引物，克隆小鼠抗體可變區(qū)和恒定區(qū)基因,，可以永久保留單克隆抗體基因序列信息,，為后續(xù)專利保護、構(gòu)建基因工程抗體,、抗體人源化打下基礎(chǔ),。

知禾擁有多樣化的雜交瘤細胞抗體基因測序方案和豐富的測序經(jīng)驗，目前已累計交付1000+測序訂單,。